クライオ電子顕微鏡によりATP合成酵素 FoF1 のスタートアップ機構を解明

■研究体制

京都産業大学と大阪大学蛋白質研究所の研究グループ

■発表論文

「Structural basis of unisite catalysis of bacterial F_oF₁-ATPase」

（F_oF₁-ATPase のユニサイト触媒の分子基盤）

■著者

中野敦樹＊　岸川淳一、中西温子、光岡薫、横山謙＄

＊筆頭著者、＄責任著者

■概要

私たちの生命活動は、高エネルギー物質であるATP(アデノシン三リン酸)によって支えられており、その大部分は、ATP合成酵素F_oF₁ により合成されています。F_oF₁は、またATPを分解することで回転する回転分子モータータンパク質でもあります。

F_oF₁ には ATP が結合する3つの触媒部位があり（図１）、すべての結合部位に ATP が結合した時に回転が連続的に起こります（定常状態）。しかし、最初のATPが１つ目の触媒部位に結合したときに起こる触媒反応（ユニサイト触媒）では、ATPに対する親和性が高く、かつその分解速度が遅いなど、特異な性質を示すことがわかっていました。多くの研究者がユニサイト触媒機構の解明に取り組んできましたが、未だユニサイト触媒と定常状態での触媒機構との関連はわかっていませんでした。

京都産業大学の研究グループ（代表：京都産業大学生命科学部　横山謙教授）は、クライオ電子顕微鏡を用いた構造解析により、ユニサイト触媒の起こる様子を捉えることに成功しました。その結果、ユニサイト触媒は、定常状態とは異なる機構で起こる反応であり、ATPに対する高親和性は、ユニサイト触媒に特有な現象であることが示唆されました。今回の成果により、F_oF₁の分子機構の全容解明に一歩近づくことができました。

■背景

私たちの生命は、ATP(アデノシン三リン酸)を加水分解することによって得られるエネルギーで生命活動を維持しています。ほとんどの ATP は回転分子モーターである F_oF₁-ATPaseによって合成されます。F_oF₁は、親水性のF₁部分と膜内在性の F_o から構成されます。単離した F₁ は、３つのαβからなるシリンダー構造 (α₃β₃)の中心に回転軸であるγサブユニットが刺さった構造からなります（図１）。F₁部分単独でATPase 活性を持つことから F₁-ATPase と呼ばれ、1970年頃から現在に至るまでF₁-ATPaseを使った多くの研究が行われてきました。1994年にX線結晶構造解析により F₁-ATPase の構造が明らかになりました。その構造では、３つの βサブユニットは、それぞれ異なったヌクレオチド結合状態をとり、1つには ATP が結合 (β_TP)、もう一つには ADP(β_DP)が結合、最後のものにはなにも結合していませんでした (β_E)。そして、β_TPとβ_DPは、閉じた構造、β_Eは、開いた構造になっていました。我々はこの構造を ”Walker 構造” と呼んでいます。定常状態での回転では、3つの β サブユニット上において、協働的にヌクレオチドの結合状態や構造を変化させることで、連続的にγサブユニットを回転させます。しかし、ATPが一つの触媒部位にしか結合できない条件 (ユニサイト条件)では、ATPに対して非常に高い親和性 (K_d = 10^-12) を示し、しかも結合した ATPをゆっくりと加水分解することが報告されていました（ユニサイト触媒）。このユニサイト触媒機構と定常状態での触媒機構との関係を解明することは、回転分子モーターの分子機構を理解する上で必要です。しかし、1994年以降、定常状態での回転機構に対する研究が進む一方、ユニサイト触媒の分子基盤は、わからないままでした。

■研究方法と成果

京都産業大学の中野敦樹（博士1年）、横山謙教授、大阪大学の岸川淳一助教（蛋白質研究所）、光岡薫教授（超高圧電子顕微鏡センター）、中西温子日本学術振興会特別研究員（超高圧電子顕微鏡センター）らのグループは、クライオ電子顕微鏡を用いることにより、ユニサイト触媒が起こる前後の構造を捉えることに成功しました。クライオ電子顕微鏡による構造解析は、X線結晶構造解析で得ることのできなかった一過性の中間体構造を決定することができます。透析処理によって内在性のヌクレオチドを取り除いた F_oF₁ を用い、F_oF₁の量に対して約1/3量のATP を加え、反応中に急速凍結しました。　得られた凍結グリッドをクライオ電子顕微鏡で撮影し、その画像を解析することで、すべての触媒サブユニットにヌクレオチドが結合していないND 構造と1つの触媒サブユニットにADP が結合したUS 構造 (ユニサイト構造)が得られました。ND構造は、Walker 構造と大きく異なっており(図1)、3つのβ がすべて開いた構造をとっていました。 US構造では、β_TPに ATP ではなく、加水分解後の ADP が結合していました。この結果から、ユニサイト触媒では、ATPはβ_DP ではなく、β_TPに結合し、β_TPで加水分解が起こるということが明らかになりました。以上のことから、F_oF₁ にヌクレオチドが結合していない初期状態から定常状態までのモデル(図2)を提案し、長年の議論に終止符を打つことができました。

■今後の展開

　本研究により、ユニサイト触媒の分子基盤、定常状態へと移行する過程を解明することができました。ATP駆動性の回転分子モーターの仕組みを理解するのに必要な重要なピースが埋まったといえます。このナノサイズで機能する分子機械の仕組みを理解することで、将来のナノマシーンの駆動部に応用できる人工分子モータータンパク質設計への応用が期待されます。

■参考図

図1　今回の研究で明らかになった F1部分の構造.

左: 横から見た F₁部分のクライオ電子顕微鏡マップ。右：点線で囲った部分を下から見た図。触媒部位が存在する3つのβ（赤、紫、青）が、α(灰色)を挟んで交互に並び、中心にγがある。ヌクレオチドを持たない初期状態（ND structure）では、3つのβが開構造をとる。Walker構造では、3つのβは、閉、閉、開構造をとる。

図2. 　F₁部分のスタートアップ機構

初期状態(ND structure)にATPが結合すると、1つのβが閉じ、加水分解、リン酸の放出まで起こったのがユニサイト構造（US structure）である。さらに、もう一つのATPが結合し、120°回転すると定常状態であるWalker構造に移行し、連続的に回転しながらATPを加水分解する。

■用語・事項の解説

1.　ユニサイト触媒

F₁部分には、三つの触媒部位が存在する。ATP１分子に対してF₁部分 3分子の比率で反応させると、F₁部分の一つの触媒部位でのみ反応が起こることになる。これをユニサイト触媒と呼ぶ。

2.定常状態での触媒反応

F₁部分に対してATPが過剰に存在する場合に起こる反応。３つある触媒部位にATPが結合した状態を繰り返しながら連続的に ATPを加水分解する。

■論文情報

論文タイトル：「Structural basis of unisite catalysis of bacterial F_oF₁-ATPase」
（F_oF₁-ATPase のユニサイト触媒機構の分子基盤）
掲載誌：PNAS Nexus電子版（Oxford 出版社）
掲載日：2022年7月11日（月）12:00（日本時間）
著者　：中野敦樹¹、岸川淳一、中西温子、光岡薫、横山謙²
（¹筆頭著者、²責任著者、）
DOI　　：https://doi.org/10.1093/pnasnexus/pgac116

■謝辞

本研究は、科学研究費補助金（基盤研究(B))20H03231、20K06514、武田特定研究（武田財団）、京都産業大学タンパク質動態研究所、感染分子研究センター、AMED(BINDS) 、文部科学省「ナノテクノロジープラットフォーム」の支援により行われました。

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研究成果